SYBR Green II(10000×)

  SYBR Green II RNA染料是一种高敏感的核酸染色试剂，可以对RNA或者是单链的DNA进行染色。使用300nm透射光显影的情况下，非变性凝胶中检测核酸的灵敏度可以达到5×10-7克。与传统的EB染料相比SYBR Green II RNA染料的灵敏度更高，可以应用于杂交前RNA质量的检测，同时不会影响后续的转膜，还可应用于变形梯度凝胶电泳（DGGE）和单链构象多态性分析（SSCP）等实验。SYBR Green II RNA染料可以代替银染和EB染色，消除了银染复杂、费时的缺点；与EB染色相比，形成的SRBR Green II -RNA复合物所激发的荧光是EB-RNA复合物激发荧光的7倍。SYBR Green II RNA染料并不是特异性的结合RNA或者DNA单链，但是其对单链的结合效率是双链的约2倍，广泛的应用于RNA的质量分析中。

染色方法：

I)SYBR Green II RNA 染料检测核酸时即可预染也可以电泳后再进行染色。做预染使用时，取1ul贮存液加入1ml TE缓冲液或者灭菌双蒸水中混匀，再加入1ml 的6-loading buffer上样缓冲液混匀（此时溶液为1：2000稀释，即为工作液）电泳时取1-2ul工作液和5ul电泳样品混匀后直接上样。注意：须将商品化的核酸MARKER作一定倍数的稀释（1/5-1/10），这样才能得到比较理想的结果。

II)电泳后染色。电泳后，在室温、避光的情况之下准备染色液。染色液要在塑料器皿中制备而不要在玻璃器皿中，因为玻璃表层对该试剂有吸附作用。

III)染料取出后室温放置，恢复室温后简单离心混匀。

IV)染色液使用1×TBE缓冲液进行1：10，000稀释。如果是琼脂糖甲醛变性胶，用1×TBE做1：5，000的稀释。由于SYBR Green II RNA染色液灵敏度高，所以要选用新鲜的1×TBE缓冲液进行稀释，以免缓冲液中残存的杂质产生背景，影响实验结果。注意：为了提高染色的灵敏度，要确定缓冲液的PH值在7.5和8之间，因为SYBR Green II RNA染色液对PH敏感。

V)把胶放在塑料的染色容器中，加入足够染色液使之覆盖整块胶。用铝箔遮盖或者是放在暗处避光。在染色之前没有必要先将胶中的变性剂如尿素和甲醛洗出来，因为SYBR Green II RNA染色液复合物发出的荧光在甲醛或者尿素存在时不会猝灭。

VI)在室温下轻轻摇晃凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的最佳染色时间是10-40分钟，琼脂糖凝胶的最佳染色时间是20-40分钟。染色时间也可能随着凝胶的厚度和浓度变化。由于其荧光本底很低，凝胶染色后无需脱色。染色工作放在2-8°C避光保存，可以重复使用3-4次。注意：SYBR Green II RNA染色液不影响RNA向膜上的转移和northern中的后续实验。

VII)染色胶显色和成像：SYBR Green II RNA染色液复合物所激发的荧光可以使用300nm和254nm光波照射，通过Wratten 15 滤光片检测。注意：由于荧光本底较低，所以可以通过适当延长曝光时间的方法检测痕量的核酸。

提示：请带手套操作!!

贮存

SYBR Green II RNA染色液保存于DMSO溶液中，此贮存液于保存温度为-20°C，放置于避光干燥器中，在以上条件下，可在保存一年。稀释工作液在2-8°C可以放置一周，在室温放置3-4天。