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Northern Blot原理及实验方法
发布于:2011-01-27 0:26:13 点击次数:4070次  

实验方法:
[仪器、试剂、材料]
(一)仪器
恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV 交联仪,杂交炉,恒温摇床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电炉(或微波炉),离心管,烧杯,量筒,三角瓶,等。
(二)材料
总RNA样品或mRNA样品,探针模板DNA(25 ng),尼龙膜
(三)试剂
NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),琼脂糖,DEPC, X光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]
1. 用具的准备:
180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。

2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。

3.制胶:
1. 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)
2. 在通风厨中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子
如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。
4.胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的buffer。)
5.检查点样孔。

4. RNA样品的制备
在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。

5. 电泳:
1. 将RNA样品小心加到点样孔中。
2. 在5V/cm下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中,每隔30min短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。
3. 紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。
注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6. 转膜
1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用DEPC水冲洗。
2.用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用DEPC水冲洗二次。
3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。
4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。
5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约2mm,以防止漏气。
6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。
7.打开真空泵,使压强维持在50~58mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。
8.转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒,去除残余的胶和盐。
9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。
10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
12.将膜在-20℃保存。
7. 探针的制备
1.在1.5ml离心管中配制以下反应液:
模板DNA(25 ng)     1ul
Random Primer 2ul
灭菌水 11ul
总体积:14ul
2.95°C加热3分钟后,迅速放置于冰冷却5min。
3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液:
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4.混匀后(25ul),37°C下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。
5.65°C加热5min使酶失活。
   
8. 探针的纯化及比活性测定:
1.准备凝胶:将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE(PH7.6)。
2.取1ml一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
3.将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟,凝胶压紧后,补加Sephadex G-50凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处
4.100ul STE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。
5.倒掉离心管中的溶液后,将一去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5ml离心管。
6.将标记的DNA样品加入25 ul STE,取出0.5ul点样于DE8 paper上,其余上样于层析柱上。
7.1600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.
8. 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml)。 

9.预杂交:
1.将预杂交液在杂交炉中68℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。
2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液),42℃预杂交4 hr。

10.探针变性:
1.用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
2.90℃热处理稀释后探针10min后,立即放置于冰上5min。
3.短暂离心,将溶液收集到管底。

11.杂交:
1.加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。
2.42℃杂交过夜(14~24hr)。
杂交完后,将杂交液收集起来于-20℃保存。

12.洗膜:
1.低严紧性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液),室温下,摇动洗膜5min两次。
2.高严紧性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液),42℃ 摇动洗膜20min两次。

13.曝光:
1. 将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。
2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间
3. 将X光底片覆盖与膜上,曝光
4. 冲洗X光底片,扫描记录结果。

14.去除膜上的探针:将200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后,将膜放入,室温下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。

15.杂交结果


操作应该小心,但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡
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